Constantin avait invité les 1800 évêques de l'église chrétienne (environ 1000 à l'est et 800 à l'ouest), mais seulement 250 à 320 évêques ont participé. Eusèbe de Césarée en a compté 250, Athanase d'Alexandrie 318, et Eustathius d'Antioche 270 (tous trois étaient présents au concile). Plus tard, Socrate Scholasticus en a compté plus de 300, et Evagrius, Hilarius, Jérôme et Rufinus en ont compté 318.
Les évêques ont pu se rendre gratuitement au Conseil et y être logés. Ces évêques ne voyageaient pas seuls ; chacun avait la permission d'emmener avec lui deux prêtres et trois diacres ; le nombre total de participants aurait donc été supérieur à 1500. Eusèbe parle d'une foule presque innombrable de prêtres, de diacres et d'acolytes qui l'accompagnaient.
Une importance particulière est également accordée à ce conseil car la persécution des chrétiens vient de prendre fin avec l'édit de Milan de février 313 des empereurs Constantin et Licinius.
Les évêques de l'Est formaient la grande majorité. Parmi eux, le premier rang était détenu par les trois patriarches : Alexandre d'Alexandrie, Eustathius d'Antioche et Macarius de Jérusalem. Les provinces de langue latine envoyaient au moins cinq représentants : Marcus de Calabre d'Italie, Cecilien de Carthage d'Afrique, Hosius de Cordoue d'Hispanie, Nicasius de Dijon de Gaule et Domnus de Stridon de la province du Danube. Le pape Silvestre I n'était pas présent, disant qu'il était malade, mais il était représenté par deux prêtres.
Athanase d'Alexandrie, jeune diacre et compagnon de l'évêque Alexandre d'Alexandrie, était parmi les assistants. Athanase a finalement passé la plus grande partie de sa vie à lutter contre l'arianisme. Alexandre de Constantinople, alors presbytre, était également présent en tant que représentant de son vieil évêque.