Une enzyme de restriction est une enzyme qui coupe l'ADN à des endroits particuliers. Elle travaille au niveau ou à proximité de séquences de nucléotides de reconnaissance spécifiques appelées "sites de restriction". Pour couper l'ADN, toutes les enzymes de restriction font deux incisions, une à travers chaque brin de la double hélice de l'ADN.

Ces enzymes se trouvent dans les bactéries et les archées et les défendent contre les virus envahissants, qui sont des bactériophages.

À l'intérieur d'un procaryote, les enzymes de restriction coupent sélectivement l'ADN étranger selon un processus appelé restriction. L'ADN hôte est protégé par une autre enzyme qui protège l'ADN hôte et bloque le clivage. Ensemble, ces deux processus constituent le système de modification par restriction. Il s'agit du système immunitaire le plus précoce et le plus simple. Ils constituent également une sorte d'élément génétique mobile et égoïste.

Plus de 3000 enzymes de restriction ont été étudiées en détail, et plus de 600 d'entre elles sont disponibles dans le commerce. Ces enzymes sont couramment utilisées pour la modification de l'ADN dans les laboratoires, et constituent un outil vital pour le clonage moléculaire.