Le jeu commence par le réveil de Chell dans une petite pièce vitrée qui ne comporte qu'un lit, des toilettes et une radio à l'intérieur. GLaDOS lui annonce que les tests vont bientôt commencer, et un portail orange s'ouvre sur l'un des murs. Une fois qu'elle a franchi le portail, elle entre dans les salles de test et commence les tests. Il y a en tout 20 salles de test, appelées "Test Chambers".
Les tests sont simples au départ. Chell doit prendre des boîtes, appelées "cubes de stockage pondérés" (en abrégé "cubes"), et les placer sur des boutons, ce qui ouvrira la porte de la sortie de la chambre. À ce stade, le GLaDOS parle à Chell comme un guide, la félicite et lui promet le gâteau à la fin des tests. Vers le début du jeu, Chell reçoit l'appareil portatif Aperture Science, également connu sous le nom de Portal Gun. Au début, son Portal Gun ne fait que des portails bleus et les portails orange sont fabriqués par GLaDOS. Plus tard, Chell reçoit le Portal Gun complet et peut fabriquer des portails bleus et oranges.
Les tests deviennent de plus en plus dangereux plus loin dans le jeu. Dans certaines pièces, il y a du poison sur le sol. Dans d'autres, il y a des boules d'électricité appelées High Energy Pellets qui tueront Chell si elle les touche. Pendant ces tests, GLaDOS devient de plus en plus sarcastique, donnant à Chell des conseils inutiles, comme "Le sol ici va te tuer". Essayez de l'éviter". A un moment donné, GLaDOS dit à Chell qu'une chambre est cassée et qu'elle doit passer par une chambre pleine de sentinelles, appelées Tourelles, à la place. Si une Tourelle voit Chell, elle lui tirera dessus jusqu'à ce qu'elle meure. Dans cette chambre se trouve une pièce cachée. Dans la pièce cachée, il y a des dessins et des écritures sur les murs laissés par une personne inconnue. L'écriture dit des choses comme "le gâteau est un mensonge" et "elle regarde toujours" avec l'image d'un appareil photo. Il y a d'autres pièces de ce type dans des chambres ultérieures.
Dans une autre chambre, Chell doit utiliser le cube de compagnon pondéré, qui ressemble à un cube de stockage pondéré avec des coeurs dessus, pour résoudre le test. Pendant le test, GLaDOS dit à Chell plusieurs fois que le Companion Cube n'est pas vivant, mais à la fin du test, elle dit à Chell qu'elle doit "tuer" le Companion Cube pour passer au test suivant.
Lors du dernier test, Chell doit se tenir sur une plate-forme mobile. Au bout de la piste de la plate-forme, elle sera transportée dans un foyer. Le GLaDOS remercie Chell d'avoir effectué les tests. A la dernière minute, Chell utilise son Portal Gun pour échapper au piège. Alors qu'elle tente de s'échapper du bâtiment, Chell est conduite dans une pièce où elle trouve GLaDOS. Chell casse une boule blanche qui est tombée de GLaDOS. GLaDOS lui dit qu'elle a été stupide de la casser parce qu'ils ne savaient pas ce que c'était, mais GLaDOS découvre rapidement que c'était son noyau de moralité. Elle raconte à Chell que les gens qui travaillaient pour Aperture Science l'ont installé pour qu'elle arrête de les tuer avec "Deadly Neuro-Toxin". Parce que Chell l'a brisée, GLaDOS peut à nouveau utiliser la neurotoxine. Chell a un délai de 6 minutes pour tuer GLaDOS avant que la Neuro-Toxine ne tue Chell. Après avoir brisé des morceaux d'elle et les avoir brûlés, GLaDOS est détruit et Chell s'échappe du bâtiment.
Après l'évasion de Chell, elle s'évanouit, et un robot la traîne à nouveau dans le bâtiment. Pendant le générique, GLaDOS chante une chanson intitulée "Still Alive" écrite par Jonathan Coulton, qui dit que même si Chell l'a tuée, elle est toujours en vie.
