Pérouse était une colonie ombrienne mais apparaît pour la première fois dans l'histoire écrite sous le nom de Perusia, l'une des douze villes confédérées d'Étrurie. Elle est mentionnée pour la première fois dans le récit de Q. Fabius Pictor, utilisé par Livy, de l'expédition menée contre les Étrusques par Fabius Maximus Rullianus en 310 ou 309 av. À cette époque, une indutiae (trêve) de trente ans a été convenue ; cependant, en 295 av. J.-C., Perouse a participé à la troisième guerre des Samnites et a été réduite, avec Volsinii et Arretium (Arezzo), à rechercher la paix l'année suivante.
En 216 et 205 av. J.-C., Pérouse assiste Rome dans la seconde guerre punique. On ne sait pas grand-chose d'autre avant 41-40 av. J.-C., lorsque Lucius Antonius (frère de Marc Antoine) s'y réfugie, dans la guerre civile romaine entre Marc Antoine et Octave. Une grande partie de l'ancienne Pérouse a été détruite par Octave (devenu plus tard l'empereur Auguste) après un long siège, et ses sénateurs ont été envoyés à la mort. Un certain nombre de balles en plomb utilisées par des frondeurs ont été retrouvées dans et autour de la ville. La ville a été brûlée, nous dit-on, à l'exception des temples de Vulcain et de Junon. Les immenses murs de la terrasse étrusque, naturellement, n'ont guère souffert. Par la suite, la ville, dont le territoire s'étendait sur un kilomètre, a été autorisée à être occupée par quiconque venait. Elle a dû être reconstruite presque d'un seul coup, car il existe plusieurs socles de statues portant les mots "Augusto sacr(um) Perusia restituta". Cependant, la ville ne devint une colonie qu'en 251-253 après J.-C., lorsqu'elle fut réinstallée sous le nom de Colonia Vibia Augusta Perusia, sous l'empereur C. Vibius Trebonianus Gallus.
Pérouse est à peine mentionnée, sauf par les géographes, jusqu'à ce qu'elle soit la seule ville d'Ombrie à résister à Totila, qui l'a capturée et a mis la ville à sac en 547, après un long siège, apparemment après l'évacuation de la garnison byzantine de la ville. Les négociations avec les forces assiégeantes ont été confiées à l'évêque de la ville, Herculanus, en tant que représentant des habitants. Totila aurait ordonné que l'évêque soit écorché et décapité. Saint Herculanus (Sant'Ercolano) est devenu plus tard le saint patron de la ville.
À l'époque lombarde, on parle de Pérouse comme d'une des principales villes de Tuscia. Au IXe siècle, avec le consentement de Charlemagne et de Louis le Pieux, elle passe sous les papes ; mais au XIe siècle, sa commune s'affirme et pendant de nombreux siècles, la ville continue à maintenir une vie indépendante, en faisant la guerre à de nombreuses terres et villes voisines : Foligno, Assise, Spoleto, Todi, Sienne, Arezzo, etc. En 1186, Henri VI, empereur du Saint Empire romain, rex romanorum et futur empereur, accorda la reconnaissance diplomatique au gouvernement consulaire de la ville ; par la suite, le pape Innocent III, dont le but principal était de donner une dignité d'État aux dominions ayant constitué le patrimoine de Saint-Pierre, reconnut la validité de la déclaration impériale et reconnut les pratiques civiques établies ayant force de loi.
En diverses occasions, les papes trouvèrent asile dans ses murs, à la suite des conflits de Rome, et il fut le lieu de rencontre de cinq conclaves (papauté de Pérouse), dont ceux qui élurent Honorius III (1216), Clément IV (1285), Célestin V (1294) et Clément V (1305) ; la présence papale se caractérisa par une règle de temps de paix entre les rivalités internes. Mais Pérouse n'avait pas l'intention de se contenter de servir les intérêts papaux et n'accepta jamais la souveraineté papale : la ville exerçait une juridiction sur les membres du clergé. De plus, en 1282, Pérouse fut excommuniée en raison d'un nouveau conflit militaire contre les Gibelins, malgré l'interdiction papale. D'autre part, à côté du griffon de Pérouse en bronze du XIIIe siècle, au-dessus de la porte du Palais des Prieurs, se dresse, comme emblème guelfalfe, le lion : Pérouse est restée fidèle, pour la plupart, au parti guelfe dans les luttes des Guelfes et des Gibelins. Cependant, cette tendance dominante était plutôt une stratégie politique anti-germanique et italienne. La présence angevine en Italie apparaît comme un contrepoids aux pouvoirs papaux : en 1319, Pérouse déclare le Saint Louis angevin de Toulouse "Protecteur de la souveraineté de la ville et du Palais des Prieurs" et place sa figure parmi les autres saints patrons au-dessus de la riche porte du Palais des Prieurs. À la moitié du XIVe siècle, Bartholus de Sassoferrato, juriste de renom, affirmait que Pérouse ne dépendait ni du soutien impérial ni du soutien papal. En 1347, à l'époque de la malheureuse entreprise de Rienzi pour faire renaître la République romaine, Pérouse envoya dix ambassadeurs pour lui rendre hommage ; et, lorsque les messagers papaux cherchèrent à la forcer par des soldats étrangers, ou à exiger des contributions, ils rencontrèrent une résistance vigoureuse, qui entra en guerre ouverte avec le pape Urbain V en 1369 ; en 1370, la partie noble parvint à un accord en signant le traité de Bologne et Pérouse fut contrainte d'accepter un légat papal ; cependant, le vicaire général des États pontificaux, Gérard du Puy, abbé de Marmoutier et neveu du pape Grégoire IX, fut expulsé par un soulèvement populaire en 1375, et sa fortification de Porta Sole fut rasée.
Au XIVe siècle, la paix civile est constamment troublée par les luttes entre le parti représentant le peuple (Raspanti) et les nobles (Beccherini). Après l'assassinat en 1398 de Biordo Michelotti, qui s'était fait seigneur de Pérouse, la ville devint un pion dans les guerres d'Italie, passant à Gian Galeazzo Visconti (1400), au pape Boniface IX (1403) et à Ladislas de Naples (1408-14) avant de s'installer dans une période de bonne gouvernance sous la Signoria du condottiero Braccio da Montone (1416-24), qui parvint à une concordance avec la papauté. Après les atrocités mutuelles des familles Oddi et Baglioni, le pouvoir fut enfin concentré dans les Baglioni qui, bien que n'ayant aucune position légale, défiaient toute autre autorité, bien que leurs sanglantes querelles internes aient culminé en un massacre, le 14 juillet 1500. Gian Paolo Baglioni fut attiré à Rome en 1520 et décapité par Léon X ; et en 1540, Rodolfo, qui avait tué un légat papal, fut vaincu par Pier Luigi Farnese, et la ville, capturée et pillée par son soldat, fut privée de ses privilèges. Une citadelle connue sous le nom de Rocca Paolina, du nom du pape Paul III (Paolo en italien), fut construite, sur les plans d'Antonio da Sangallo le Jeune "ad coercendam Perusinorum audaciam".
En 1797, la ville a été conquise par les troupes françaises. Le 4 février 1798, la République de Tibérine est formée, avec Pérouse comme capitale et le tricolore français comme drapeau. En 1799, la République de Tibérine a fusionné avec la République romaine.
En 1832, 1838 et 1854, Pérouse a été frappée par des tremblements de terre. Après l'effondrement de la république romaine de 1848-49, la Rocca fut en partie démolie, puis saisie en mai 1849 par les Autrichiens. En juin 1859, le peuple se rebelle contre l'autorité temporelle du pape et établit un gouvernement provisoire, mais l'insurrection est réprimée dans le sang par les troupes de Pie IX. En septembre 1860, la ville est enfin réunie, avec le reste de l'Ombrie, au sein du royaume d'Italie.
