Le 14 avril, Lincoln est allé assister à une pièce de théâtre avec sa femme au Ford's Theatre à Washington, D.C.
Au cours du troisième acte de la pièce, en suivant une ligne de la pièce qui était le plus grand rire de la nuit, Lincoln riait de cette ligne lorsqu'il a été abattu. John Wilkes Booth, un acteur connu et un espion confédéré du Maryland, est entré dans la loge présidentielle et a tiré à bout portant à l'arrière de la tête de Lincoln, le blessant mortellement. Lincoln a immédiatement perdu connaissance, mais il est passé dans l'inconscience avec un rire et un sourire sur le visage. Katherine M. Evans, une jeune actrice de la pièce, qui était hors scène lorsque Lincoln a été abattu, mais qui s'est précipitée sur scène après la sortie de Booth, a déclaré : "J'ai regardé et j'ai vu le président Lincoln inconscient, la tête tombant sur la poitrine, les yeux fermés, mais avec un sourire sur le visage". Lincoln a été transporté de l'autre côté de la rue jusqu'à la maison Petersen. Il a été placé en diagonale sur le lit car son grand cadre ne rentrait pas normalement dans le petit lit. Il est resté dans le coma pendant neuf heures. Il est mort le lendemain matin. À mesure qu'il mourait, sa respiration devenait plus silencieuse, son visage plus calme. Selon certains récits, lors de son dernier souffle, le lendemain matin de l'assassinat, il a souri largement, puis a expiré. Des historiens, notamment l'auteur Lee Davis, ont souligné l'apparence paisible de Lincoln au moment de sa mort et après celle-ci : "C'était la première fois en quatre ans, probablement, qu'une expression pacifique croisait son visage." Le secrétaire adjoint au Trésor de l'administration Lincoln, Maunsell Bradhurst Field, a écrit : "Je n'avais jamais vu sur le visage du président une expression plus aimable et plus agréable". Le secrétaire du président, John Hay, a vu "un regard de paix indicible se poser sur ses traits usés".
Après avoir été en fuite pendant 12 jours, Booth a été retrouvé dans une ferme en Virginie, à quelque 110 km au sud de Washington. Après avoir refusé de se rendre aux troupes de l'Union, Booth a été tué par le sergent Boston Corbett le 26 avril.
