En 1606, le Smith a été engagé par la Virginia Company pour s'installer dans la colonie de Virginie dans un but lucratif. Ils s'embarquent sur trois navires, en décembre 1606. Le Smith avait un serviteur nommé Samuel Collier. Samuel Collier restait près de lui pendant la majeure partie du voyage.
Il y a eu des problèmes pendant le voyage et Smith a été accusé de mutinerie. Le capitaine Newport avait prévu de l'exécuter. Le capitaine ouvrit une lettre d'ordre de la Compagnie de Virginie qui stipulait que Smith devait être l'un des chefs de la nouvelle colonie, donc Smith ne fut pas tué.
Les Anglais sont arrivés en avril 1607 et le capitaine Wingfield a choisi Jamestown pour y établir la colonie. En été, les colons vivaient encore dans des logements temporaires. Après le voyage de quatre mois en mer, les réserves de nourriture étaient seulement suffisantes pour que chaque personne puisse prendre une ou deux tasses de farine de céréales par jour. En raison du temps et du manque de nourriture, les maladies se sont répandues dans la population et en septembre, plus de la moitié des habitants étaient morts.
En décembre 1607, Smith était à la recherche de nourriture et fut capturé par des Amérindiens. Il a été emmené pour rencontrer le chef de la tribu Powhatan. Le village se trouvait à environ 15 miles de Jamestown. Smith a été libéré sans dommage et a fait honneur en partie à la fille du chef, Pocahontas, qui s'est jetée sur son corps. Voyant cela, son père a eu pitié de Smith et il a été ramené sain et sauf à Jamestown. Cette rencontre marqua le début d'une relation amicale entre les indigènes, Smith et les colons de Jamestown. Début janvier 1608, près de 100 nouveaux colons arrivent avec le capitaine Newport, et par imprudence, le village est incendié. Cet hiver-là, la rivière James a gelé et les colons ont été contraints de vivre dans les ruines. Pendant ce temps, Newport et son équipage perdirent beaucoup de temps à charger leurs navires de pyrite de fer (l'or des fous). Les réserves de nourriture se sont épuisées et bien que les Amérindiens aient apporté de la nourriture, Smith a écrit que "plus de la moitié d'entre nous sont morts".
En avril 1608, un bateau a apporté des provisions et 50 nouveaux colons, que Smith a mis à construire des logements et à planter des cultures.
Au cours de l'été 1608, Smith quitte Jamestown pour explorer la région de la baie de Chesapeake et chercher de la nourriture dont il a grand besoin. Il a réalisé une carte qui allait être d'une grande valeur pour les explorateurs de Virginie pendant plus d'un siècle. En son absence, Smith a laissé son ami Matthew Scrivener, comme gouverneur à sa place. Scrivener se noyera plus tard dans une tempête lors d'un voyage malheureux à Hog Island. Smith est élu président du conseil local en septembre 1608 et instaure des règles strictes.
En octobre 1608, un navire est arrivé avec 70 nouveaux colons, dont les premières femmes. Quelques artisans allemands et polonais sont également arrivés, mais ils n'ont pas apporté de vivres. Après cela, Smith a essayé d'obtenir de la nourriture des Amérindiens et il a fallu des menaces de force militaire pour qu'ils obéissent. Powhatan était effrayé par le grand nombre d'hommes blancs qui arrivaient dans la région et essayait de les affamer.
Smith a découvert que certains colons et Amérindiens n'aimaient pas ses règles et avaient l'intention de le tuer. Smith a écrit qu'il avait été averti par Pocahontas. Il convoqua une réunion et dit aux hommes qui ne travaillaient pas que "celui qui ne travaillera pas ne mangera pas..." Après cela, la situation s'est améliorée.
Pendant trois mois au début de 1609, en février, mars et avril, tout allait bien à Jamestown : de nombreuses habitations ont été construites, des hectares de terre ont été défrichés et bien d'autres travaux ont été effectués. Puis, en avril, les rats et l'humidité ont détruit tout le maïs entreposé. Ils avaient grand besoin de nourriture et Smith envoya un grand groupe de colons pour pêcher et d'autres pour ramasser des coquillages en aval. Ils revinrent sans nourriture et furent assez disposés à accepter les maigres rations qui leur étaient offertes. Cela mit Smith en colère et il leur ordonna d'échanger leurs fusils et leurs outils contre des fruits des Indiens et ordonna à tout le monde de travailler, sinon ils devraient quitter la sécurité du fort. Certains partirent et se rendirent dans les villages amérindiens, mais les gens de Powhatan se conformèrent également à la loi de Smith selon laquelle celui qui ne travaille pas ne mange pas. Cette loi est restée en vigueur jusqu'à ce qu'ils soient presque affamés et qu'ils rentrent chez eux.
À un moment donné, un navire inattendu est arrivé, commandé par Samuel Argall. Il avait de la nourriture et du vin que Smith avait achetés en promettant de rembourser. Argall apporta également la nouvelle que la Virginia Company envoyait plus de fournitures et de colons à Jamestown avec un nouveau gouverneur, Lord De la Warr.
Lors d'un voyage en Virginie en mai 1609, Sir Thomas Smith, trésorier de la Virginia Company, a fait venir environ 500 colons, dont des femmes et des enfants. Une flotte de neuf navires prit la mer. L'un d'eux coula dans une tempête peu après avoir quitté le port. Le Sea Venture a fait naufrage aux Bermudes avec l'amiral et Stephen Hopkins à son bord. Un an plus tard, en mai 1610, ils étaient arrivés à Jamestown dans de petites embarcations qu'ils avaient fabriquées. Gates s'est vite rendu compte qu'il n'y avait pas assez de nourriture pour subvenir aux besoins de toute la colonie et a décidé d'abandonner Jamestown. Alors que leurs bateaux quittaient la région de Jamestown, ils rencontrèrent un navire transportant le nouveau gouverneur, Lord De la Warr, qui leur ordonna de revenir à Jamestown.
En août 1609, John Smith fut très surpris de voir arriver plus de 300 nouveaux colons. Londres envoyait de nouveaux colons sans planifier comment et où ils allaient vivre.
Le capitaine John Smith a été gravement blessé par une explosion accidentelle de poudre à canon dans son canot. Smith s'est rendu en Angleterre pour y être soigné en octobre 1609. Il avait passé deux ans et demi à essayer de faire de son mieux pour Jamestown. Il ne revint jamais en Virginie. L'histoire a confirmé sa grande contribution à Jamestown dans ses premières années.
Les colons continueraient à mourir de diverses maladies et affections, et on estime que 150 des 500 colons ont survécu cet hiver-là. Malgré cela, la Virginia Company continua à financer et à transporter des colons pour soutenir Jamestown. Pendant les cinq années suivantes, les gouverneurs Gates et Sir Thomas Dale continuèrent à maintenir une discipline stricte, Sir Thomas Smith à Londres essayant de trouver des artisans qualifiés et d'autres colons à envoyer à Jamestown.
