Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse

Histoire

Les premiers documents de recherche sur la chromatographie gaz-liquide ont été publiés en 1950. Les chimistes utilisaient différents détecteurs pour voir que les composés s'écoulaient à la fin de la chromatographie. La plupart des détecteurs détruisaient les composés, car ils les brûlaient ou les ionisaient. Ces détecteurs laissaient les chimistes deviner l'identité exacte de chaque composé dans l'échantillon. Dans les années 1950, Roland Gohlke et Fred McLafferty ont mis au point une nouvelle machine combinée. Ils ont utilisé un spectromètre de masse comme détecteur en chromatographie en phase gazeuse. Ces premiers appareils étaient grands, fragiles et, à l'origine, limités aux laboratoires.

La conception était complexe. L'intervalle de temps entre les différents composés s'écoulant du chromatographe était difficile à contrôler. Ainsi, le spectromètre de masse devait finir de travailler sur un composé avant que le suivant ne s'écoule du chromatographe. Dans les premiers modèles, les mesures du spectromètre de masse étaient enregistrées sur du papier graphique. Des chimistes hautement qualifiés étudiaient les modèles de pics pour identifier chaque composé. Dans les années 1970, des convertisseurs analogique-numérique ont été ajoutés aux spectromètres de masse. Cela a permis aux ordinateurs de stocker et d'interpréter les résultats. À mesure que les ordinateurs devenaient plus rapides et plus petits, la GC-MS s'est accélérée et s'est répandue des laboratoires à la vie de tous les jours. Aujourd'hui, les instruments GC-MS informatisés sont largement utilisés pour la surveillance environnementale de l'eau, de l'air et du sol. Ils sont également utilisés dans la réglementation de l'agriculture, la sécurité alimentaire et dans la découverte et la production de médicaments.

Le développement des petits ordinateurs a contribué à la simplification des machines GC-MS. Il a également permis de réduire considérablement le temps nécessaire à l'analyse d'un échantillon. Electronic Associates, Inc. (EAI) était l'un des principaux fournisseurs américains d'ordinateurs analogiques. En 1964, EAI a commencé à développer un spectromètre de masse commandé par ordinateur sous la direction de Robert E. Finnigan. En 1966, plus de 500 instruments d'analyse de gaz ont été vendus. En 1967, la Finnigan Instrument Corporation (FIC) est créée. Au début de 1968, elle a livré les premiers prototypes d'instruments quadripolaires GC-MS à Stanford et à l'université de Purdue. FIC a finalement été rebaptisée Finnigan Corporation et s'est imposée comme le leader mondial des systèmes GC-MS.

Fonctionnement de base

La GC-MS permet de trouver tous les composés mélangés dans un objet échantillon. L'opérateur dissout l'échantillon dans un liquide. L'opérateur injecte ensuite le liquide dans un courant de gaz. (On utilise le plus souvent de l'hélium, de l'hydrogène ou de l'azote gazeux.) Le gaz s'écoule dans un tube muni d'un revêtement spécial. Comme chaque composé de l'échantillon adhère au revêtement de manière différente, chaque composé sort du tube à un moment différent. Le revêtement est donc utilisé pour séparer chaque composé qui a été mélangé dans l'échantillon. Lorsque chaque composé sort à l'extrémité du tube, il est ionisé et reçoit une charge électrique. La plupart des composés se séparent lorsqu'ils sont ionisés. Les différents morceaux volent sous un aimant qui les sépare en fonction de leur poids et de leur charge. Un ordinateur mesure ensuite tous les morceaux de chaque composé. En comparant les mesures à une bibliothèque de composés connus, l'ordinateur établit une liste des noms de tous les composés de l'échantillon. L'ordinateur peut également déterminer la quantité de chaque composé présent dans l'échantillon.

Instrumentation

Le GC-MS est composé de deux éléments principaux : le chromatographe en phase gazeuse et le spectromètre de masse. Le chromatographe en phase gazeuse utilise une colonne capillaire qui dépend des dimensions de la colonne (longueur, diamètre, épaisseur du film) ainsi que des propriétés de la phase (par exemple, 5 % de phényl polysiloxane). La différence de propriétés chimiques entre les différentes molécules d'un mélange séparera les molécules au fur et à mesure que l'échantillon se déplacera sur la longueur de la colonne. Les molécules prennent un temps différent (appelé temps de rétention) pour sortir (éluer) du chromatographe en phase gazeuse. Cela permet au spectromètre de masse en aval de capturer, ioniser, accélérer, dévier et détecter séparément les molécules ionisées. Pour ce faire, le spectromètre de masse casse chaque molécule en fragments ionisés et détecte ces fragments en utilisant leur rapport masse/charge.

Ces deux machines, utilisées ensemble, permettent une précision d'identification des substances beaucoup plus fine que chacune des deux unités utilisées séparément. Il n'est pas possible d'identifier avec précision une molécule particulière par chromatographie en phase gazeuse ou spectrométrie de masse uniquement. Le processus de spectrométrie de masse nécessite normalement un échantillon très pur. Dans le passé, la chromatographie en phase gazeuse utilisait d'autres détecteurs tels qu'un détecteur à ionisation de flamme. Ces détecteurs ne peuvent pas séparer les différentes molécules qui prennent le même temps pour traverser la colonne. (Lorsque deux molécules différentes ont le même temps de rétention, on dit qu'elles "co-élutent"). Les molécules co-élutées confondent les programmes informatiques qui lisent un seul spectre de masse pour les deux molécules.

Parfois, deux molécules différentes peuvent également présenter un schéma similaire de fragments ionisés dans un spectromètre de masse (spectre de masse). La combinaison de ces deux processus réduit les possibilités d'erreur. Il est extrêmement peu probable que deux molécules différentes se comportent de la même manière dans un chromatographe en phase gazeuse et dans un spectromètre de masse. Par conséquent, si un spectre de masse correspond à l'analyte d'intérêt, le temps de rétention de ce spectre peut être vérifié par rapport à un temps de rétention caractéristique de la chromatographie en phase gazeuse, ce qui permet d'accroître la certitude que l'analyte se trouve dans l'échantillon.

Types de détecteurs de spectromètre de masse

Le type de MS le plus courant associé à un GC est le spectromètre de masse quadripolaire. Hewlett-Packard (aujourd'hui Agilent) le commercialise sous le nom de "Mass Selective Detector" (MSD). Un autre détecteur relativement courant est le spectromètre de masse à piège à ions. On peut également trouver un spectromètre de masse à secteur magnétique. Toutefois, ces instruments particuliers sont chers et encombrants et ne se trouvent généralement pas dans les laboratoires de services à haut débit. D'autres détecteurs sont utilisés, tels que le temps de vol (TOF), les quadrupôles en tandem (MS-MS) (voir ci-dessous), ou dans le cas d'un piège à ions MSn. Le n indique le nombre d'étages de spectrométrie de masse.

L'intérieur du GC-MS, avec la colonne du chromatographe en phase gazeuse dans le four à droite.


Schéma GC-MS

Analyse

Un spectromètre de masse est généralement utilisé de deux manières : Le balayage complet ou la surveillance sélective des ions (SIM). Le GC-MS typique peut fonctionner seul dans un sens ou dans l'autre, ou les deux en même temps.

Scan complet MS

Lors de la collecte de données en mode de balayage complet, une gamme cible de fragments de masse est sélectionnée et mise dans la méthode de l'instrument. Un exemple d'une large gamme de fragments de masse à surveiller serait m/z 50 à m/z 400. La détermination de la gamme à utiliser est largement déterminée par ce que l'on s'attend à trouver dans l'échantillon tout en étant conscient du solvant et des autres interférences possibles. Si un EM cherche des fragments de masse avec un très faible m/z, il peut détecter de l'air ou d'autres facteurs d'interférence possibles. L'utilisation d'une large gamme de balayage diminue la sensibilité de l'instrument. L'appareil effectuera moins de balayages par seconde car chaque balayage prendra plus de temps pour détecter une plus grande gamme de fragments de masse.

L'analyse complète est utile pour déterminer les composés inconnus dans un échantillon. Elle fournit plus d'informations que la SIM lorsqu'il s'agit de confirmer ou de résoudre des composés dans un échantillon. La plupart des instruments sont contrôlés par un ordinateur qui fait fonctionner un programme informatique appelé "méthode instrumentale". La méthode instrumentale contrôle la température dans le GC, le taux de balayage MS et la gamme de tailles de fragments détectés. Lorsqu'un chimiste met au point une méthode instrumentale, il envoie des solutions de test à travers le GS-MS en mode de balayage complet. Cela permet de vérifier le temps de rétention du GC et l'empreinte des fragments de masse avant de passer à une méthode d'instrument SIM. Les instruments GC-MS spécialisés, tels que les détecteurs d'explosifs, ont une méthode d'instrument préchargée à l'usine.

Surveillance des ions sélectionnés

Dans la surveillance des ions sélectionnés (SIM), la méthode de l'instrument se concentre sur certains fragments d'ions. Seuls ces fragments de masse sont détectés par le spectromètre de masse. L'avantage du SIM est que la limite de détection est plus basse puisque l'instrument n'examine qu'un petit nombre de fragments (par exemple trois fragments) lors de chaque balayage. D'autres balayages peuvent avoir lieu chaque seconde. Comme seuls quelques fragments de masse intéressants sont surveillés, les interférences de la matrice sont généralement plus faibles. Pour améliorer les chances de lire correctement un résultat positif, les rapports d'ions des différents fragments de masse sont comparables à un étalon de référence connu.

Types d'ionisation

Après que les molécules aient parcouru la longueur de la colonne, traversé la ligne de transfert et pénétré dans le spectromètre de masse, elles sont ionisées par diverses méthodes. En général, une seule méthode d'ionisation est utilisée à un moment donné. Une fois que l'échantillon est fragmenté, il est alors détecté, généralement par une diode multiplicatrice d'électrons. La diode traite le fragment de masse ionisé comme un signal électrique qui est ensuite détecté.

Les chimistes choisissent une technique d'ionisation séparément du choix du Full Scan ou de la surveillance SIM.

Ionisation des électrons

Le type d'ionisation le plus courant est l'ionisation électronique (IE). Les molécules entrent dans la MS (la source est un quadripôle ou le piège à ions lui-même dans une MS) où elles sont frappées par des électrons libres émis par un filament. C'est comme le filament que l'on trouve dans une ampoule à incandescence standard. Les électrons frappent les molécules, ce qui provoque la fragmentation de la molécule d'une manière caractéristique qui peut être répétée. Cette technique d'"ionisation dure" entraîne la création d'un plus grand nombre de fragments ayant un faible rapport masse/charge (m/z). EI ne possède que peu de fragments, voire aucun, dont la masse est proche de celle de la molécule d'origine. Les chimistes considèrent que l'ionisation dure consiste à projeter des électrons dans les molécules de l'échantillon. En revanche, l'"ionisation douce" consiste à placer une charge sur la molécule de l'échantillon en la frappant avec un gaz introduit. Le schéma de fragmentation moléculaire dépend de l'énergie des électrons appliquée au système, généralement 70 eV (électron-volt). L'utilisation de 70 eV permet de comparer les spectres générés par l'échantillon d'essai à des spectres connus de la bibliothèque. (Les spectres de la bibliothèque peuvent provenir de logiciels fournis par les fabricants ou de logiciels développés par le National Institute of Standards (NIST-USA)). Le logiciel recherche les spectres de la bibliothèque à l'aide d'un algorithme de correspondance tel que la correspondance basée sur la probabilité ou la correspondance point produit. De nombreux organismes de normalisation des méthodes contrôlent désormais ces algorithmes et méthodes pour en assurer l'objectivité.

Ionisation chimique

Dans l'ionisation chimique (IC), un gaz réactif, généralement du méthane ou de l'ammoniac, est introduit dans le spectromètre de masse. Il existe deux types d'IC : l'IC positive ou l'IC négative. Dans les deux cas, le gaz réactif interagit avec les électrons et l'analyte et provoque une ionisation "douce" de la molécule concernée. Une ionisation plus douce fragmente la molécule à un degré moindre que l'ionisation dure de l'IE. Les chimistes préfèrent l'IC à l'IE. En effet, l'IC produit au moins un fragment de masse dont le poids est presque identique à la masse moléculaire de l'analyte concerné.

Ionisation chimique positive

Dans l'ionisation chimique positive (ICP), le gaz réactif interagit avec la molécule cible, le plus souvent avec un échange de protons. Cela produit l'espèce d'ion en quantité relativement élevée.

Ionisation chimique négative

Dans l'ionisation chimique négative (NCI), le gaz réactif diminue l'impact des électrons libres sur l'analyte cible. Cette diminution d'énergie laisse généralement le fragment en grande quantité. (Les fragments ne se fragmentent pas davantage).

Interprétation

L'objectif premier de l'analyse des instruments est de mesurer une quantité de substance. Cela se fait en comparant les concentrations relatives entre les masses atomiques dans le spectre de masse généré. Deux types d'analyse sont possibles, comparative et originale. L'analyse comparative consiste essentiellement à comparer le spectre donné à une bibliothèque de spectres pour voir si ses caractéristiques sont présentes pour un échantillon connu dans la bibliothèque. Cette analyse est mieux réalisée par un ordinateur car de nombreuses distorsions visuelles peuvent se produire en raison des variations d'échelle. Les ordinateurs peuvent également corréler davantage de données (comme les temps de rétention identifiés par la GC), afin de relier plus précisément certaines données.

Une autre méthode d'analyse permet de mesurer les pics les uns par rapport aux autres. Dans cette méthode, le pic le plus élevé est fixé à 100%. Les autres pics reçoivent une valeur égale au rapport entre la hauteur du pic et la hauteur du pic le plus haut. Toutes les valeurs supérieures à 3 % sont attribuées. La masse totale du composé inconnu est normalement indiquée par le pic parent. La valeur de ce pic parent peut être utilisée pour s'adapter à une formule chimique contenant les différents éléments que l'on pense être présents dans le composé. Le schéma isotopique dans le spectre est unique pour les éléments qui ont de nombreux isotopes. Il peut donc également être utilisé pour identifier les différents éléments présents. Cela permet de connaître la formule chimique globale de la molécule inconnue. Comme la structure et les liaisons d'une molécule se brisent de manière caractéristique, elles peuvent être identifiées à partir de la différence des pics de masse. La structure de la molécule identifiée doit être cohérente avec les caractéristiques enregistrées par GC-MS. Généralement, cette identification est effectuée automatiquement par les programmes informatiques fournis avec l'instrument. Ces programmes comparent les spectres à une bibliothèque de composés connus qui ont la même liste d'éléments qui pourraient être présents dans l'échantillon.

Une analyse "spectre complet" prend en compte tous les "pics" d'un spectre. Mais la surveillance sélective des ions (SIM) ne surveille que certains pics associés à une substance spécifique. Les chimistes partent du principe qu'à un temps de rétention donné, un ensemble d'ions est caractéristique d'un certain composé. La SIM est une analyse rapide et efficace. Le SIM fonctionne mieux lorsque l'analyste dispose d'informations préalables sur un échantillon ou ne recherche que quelques substances spécifiques. Lorsque la quantité d'informations recueillies sur les ions dans un pic chromatographique en phase gazeuse donné diminue, la sensibilité de l'analyse augmente. Ainsi, l'analyse SIM permet de détecter et de mesurer une plus petite quantité d'un composé. Mais le degré de certitude quant à l'identité de ce composé est réduit.

GC-tandem MS

Lorsqu'une deuxième phase de fragmentation de masse est ajoutée, par exemple en utilisant un deuxième quadripôle dans un instrument quadripolaire, elle est appelée MS tandem (MS/MS). Les MS/MS sont efficaces pour mesurer de faibles niveaux de composés cibles dans un échantillon avec une matrice de composés de fond qui ne présentent pas d'intérêt.

Le premier quadripôle (Q1) est relié à une cellule de collision (q2) et à un autre quadripôle (Q3). Les deux quadrupôles peuvent être utilisés en mode balayage ou statique, selon le type d'analyse MS/MS utilisé. Les types d'analyse comprennent le balayage des ions produits, le balayage des ions précurseurs, la surveillance des réactions sélectionnées (SRM) et le balayage des pertes neutres. Par exemple : Lorsque Q1 est en mode statique (en regardant une seule masse comme dans SIM), et que Q3 est en mode balayage, on obtient un spectre dit d'ions de produit (aussi appelé "spectre fille"). À partir de ce spectre, on peut sélectionner un ion produit important qui peut être l'ion produit de l'ion précurseur choisi. Cette paire est appelée "transition" et constitue la base du MRS. Le SRM est très spécifique et élimine presque complètement le fond de la matrice.

Demandes

Surveillance et nettoyage de l'environnement

De nombreux chimistes pensent que la GC-MS est le meilleur outil pour surveiller les polluants organiques dans l'environnement. Le coût de l'équipement GC-MS a beaucoup diminué. La fiabilité de la GC-MS a augmenté dans le même temps. Ces deux améliorations ont accru l'utilisation dans les études environnementales. Certains composés, tels que certains pesticides et herbicides, ne peuvent pas être identifiés par GC-MS. Ils sont trop similaires à d'autres composés apparentés. Mais pour la plupart des analyses organiques d'échantillons environnementaux, y compris de nombreuses grandes classes de pesticides, la GC-MS est très sensible et efficace.

Criminalistique

La GC-MS peut analyser les particules d'un corps humain afin d'aider à établir un lien entre un criminel et un crime. La loi accepte l'utilisation de la GC-MS pour analyser les débris d'incendie. En fait, l'American Society for Testing Materials (ASTM) dispose d'une norme pour l'analyse des débris d'incendie. Le GCMS/MS est particulièrement utile dans ce domaine car les échantillons contiennent souvent des matrices très complexes et les résultats, utilisés au tribunal, doivent être très précis.

Application de la loi

Le GC-MS est utilisé pour la détection de stupéfiants illégaux et pourrait éventuellement remplacer les chiens renifleurs de drogue. Elle est également couramment utilisée en toxicologie médico-légale. Il permet de trouver des drogues et/ou des poisons dans des échantillons biologiques prélevés sur des suspects, des victimes ou un cadavre.

Sécurité

Après les attaques terroristes du 11 septembre 2001, les systèmes de détection d'explosifs ont été intégrés dans tous les aéroports américains. Ces systèmes fonctionnent avec une multitude de technologies, dont beaucoup sont basées sur la GC-MS. Il n'y a que trois fabricants certifiés par la FAA pour fournir ces systèmes. Le premier est Thermo Detection (anciennement Thermedics), qui produit l'EGIS, une gamme de détecteurs d'explosifs basés sur la GC-MS. Le second est Barringer Technologies, qui appartient désormais à Smith's Detection Systems. Le troisième est Ion Track Instruments (qui fait partie de General Electric Infrastructure Security Systems).

Analyse des aliments, des boissons et des parfums

Les aliments et les boissons contiennent beaucoup de composés aromatiques, certains naturellement présents dans les matières premières et d'autres se formant lors de la transformation. La GC-MS est largement utilisée pour l'analyse de ces composés qui comprennent les esters, les acides gras, les alcools, les aldéhydes, les terpènes, etc. Elle est également utilisée pour détecter et mesurer les contaminants provenant de la détérioration ou de l'adultération qui peuvent être nocifs. Les contaminants sont souvent contrôlés par des agences gouvernementales, par exemple les pesticides.

Astrochimie

Plusieurs GC-MS ont quitté la terre. Deux sont allés sur Mars dans le cadre du programme Viking. Venera 11 et 12 et Pioneer Venus ont analysé l'atmosphère de Vénus avec GC-MS. La sonde Huygens de la mission Cassini-Huygens a fait atterrir une GC-MS sur Titan, la plus grande lune de Saturne. Le matériel de la comète 67P/Churyumov-Gerasimenko sera analysé par la mission Rosetta avec un GC-MS chiral en 2014.

Médecine

Les GC-MS sont utilisés dans les tests de dépistage des nouveau-nés. Ces tests permettent de déceler des dizaines de maladies métaboliques congénitales (également connues sous le nom d'erreur innée de métabolisme). La GC-MS peut déterminer les composés dans l'urine, même en très petites quantités. Ces composés ne sont normalement pas présents mais apparaissent chez les individus souffrant de troubles métaboliques. Cela devient une façon courante de diagnostiquer les MEI pour un diagnostic et un début de traitement plus précoce. Cela permet finalement d'obtenir de meilleurs résultats. Il est maintenant possible de tester un nouveau-né pour plus de 100 troubles métaboliques génétiques par un test d'urine à la naissance basé sur la GC-MS.

En combinaison avec le marquage isotopique des composés métaboliques, la GC-MS est utilisée pour déterminer l'activité métabolique. La plupart des applications sont basées sur l'utilisation du ^13C pour le marquage et la mesure des rapports ^13C-12C avec un spectromètre de masse de rapport isotopique (SMRI). Un IRMS est un spectromètre de masse avec un détecteur conçu pour mesurer quelques ions sélectionnés et des valeurs de retour sous forme de rapports.