Après avoir travaillé quelques années comme géomètre des chemins de fer avec son frère, Wallace change de vie en rencontrant Henry Walter Bates à Leicester en 1847.
L'Amazonie
Wallace et Bates ont discuté de l'idée d'une expédition en Amazonie. Le plan était de couvrir les frais en renvoyant les spécimens à Londres, où un agent les vendrait contre une commission. En outre, les voyageurs devaient "rassembler des faits pour résoudre le problème de l'origine des espèces", comme l'a dit Wallace dans une lettre à Bates. Les deux amis, qui étaient désormais tous deux des entomologistes amateurs expérimentés, se sont rencontrés à Londres pour se préparer en observant les plantes et les animaux d'Amérique du Sud dans les principales collections.
Bates et Wallace ont quitté Liverpool en avril 1848 et sont arrivés au Pará (aujourd'hui Belém) à la fin du mois de mai. Pour la première année, ils s'installent dans une villa près de la ville, où ils collectent des oiseaux et des insectes. Ensuite, ils ont accepté de faire des collectes de manière indépendante.
Pendant quatre ans, Wallace a continué à cartographier l'Amazonie, à recueillir des spécimens et à prendre des notes sur les peuples, les langues, la géographie, la flore et la faune. Le 12 juillet 1852, Wallace s'embarque pour l'Angleterre sur le brick Helen. Après vingt-huit jours en mer, le baume de la cargaison du navire prend feu et l'équipage est contraint d'abandonner le navire. Tous les spécimens que Wallace avait sur le navire, la plupart de sa collection, furent perdus. Il n'a pu sauver qu'une partie de son journal et quelques croquis. Wallace et l'équipage ont passé dix jours dans un bateau ouvert avant d'être récupérés par le brigadier Jordeson.
Les Indes orientales
De 1854 à 1862, âgé de 31 à 39 ans, Wallace a voyagé à travers les Indes orientales néerlandaises (aujourd'hui la Malaisie et l'Indonésie), pour collecter des spécimens à vendre et pour étudier la nature. Wallace a collecté plus de 125 000 spécimens dans les Indes orientales néerlandaises (plus de 80 000 coléoptères à eux seuls). Plus d'un millier d'entre eux représentaient des espèces nouvelles pour la science.
Ses observations des différences zoologiques évidentes à travers un étroit détroit de l'archipel l'ont conduit à proposer la limite zoogéographique connue aujourd'hui sous le nom de ligne Wallace. Bali et Lombok étaient deux îles de l'archipel distantes de seulement 17 miles au plus large (28 km), approximativement de la même taille et avec le même climat, sol, altitude et aspect. Pourtant, leur flore et leur faune étaient si différentes.
"Dans cet archipel, il y a deux faunes distinctes, rigoureusement circonscrites, qui diffèrent autant que celles de l'Afrique et de l'Amérique du Sud... pourtant, rien sur la carte ou sur la face des îles ne marque leurs limites. La ligne de démarcation passe entre des îles plus proches les unes des autres que d'autres appartenant au même groupe. Je pense que la partie occidentale est une partie séparée de l'Asie continentale, tandis que la partie orientale est un prolongement fragmentaire d'un ancien continent du Pacifique occidental".
Pourquoi, se demandait-il, les animaux et les plantes du côté de Bali étaient de type asiatique, alors que ceux du côté de Lombok étaient de type australasien ? Cela devait signifier que le groupe occidental avait évolué à partir d'un stock occidental commun, alors que le groupe oriental avait évolué à partir d'un stock oriental commun.
Pendant qu'il explorait l'archipel, il a affiné ses réflexions sur l'évolution et a eu sa fameuse intuition sur la sélection naturelle. En 1858, il envoya à Darwin un article exposant sa théorie ; il fut publié la même année, avec une description de la propre théorie de Darwin.
Les récits de ses études et de ses aventures dans l'archipel malais ont finalement été publiés en 1869 sous le titre The Malay Archipelago. Il est devenu l'un des journaux de voyage d'histoire naturelle les plus populaires du XIXe siècle. Il a été salué par Charles Darwin et Charles Lyell et par d'autres, comme le romancier Joseph Conrad, qui l'a appelé son "compagnon de chevet préféré".